FFPE空间转录组揭示ICB引起的皮炎和结肠炎主要由TRM和Th1/Tc1细胞因子介导
期刊名称：Cancer Immunol Res
发表时间：2022
所用组学：FFPE空间转录组
免疫检查点封锁（ICB）可以在各种类型的癌症患者中产生持久的临床反应。然而，这种治疗经常与免疫相关的不良事件（irAE）相关。25%-40%的患者在ICB期间发生皮肤irAEs（cirAEs），当患者联合使用抗 PD-1+抗CTLA-4治疗时，观察到的概率更高。ciraes在临床上可分为各种亚型。最常见的是斑状丘疹和苔藓样皮疹，而少数患者可表现为大疱性药疹。在大多数轻度cirAEs病例中，局部或口服皮质类固醇治疗足以解决皮疹问题。然而，糖皮质类固醇会抑制T细胞功能，而且有报道称，高剂量类固醇会对转移性黑色素瘤患者的生存产生负面影响。因此，为了更好地了解免疫相关皮炎的生物学特性，定制更个性化的治疗方法是很重要的。
二、研究结果
irAEs皮炎的特征可能是TRM细胞重新激活，具有Th1-、Th2-或Th17样表型。首先，作者对来自22例患者的cirAEs组织进行了染色，使用if5-plex panel，该panel包含TRM标记CD69和CD103以及CD4、CD8和CD20（图1A和B）。除了来自10个健康对照的皮肤样本染色外，作者还使用了三个牛皮癣样本作为对照组，因为这种自身免疫性皮肤病据报道是由TRM细胞引发的，并且已知有th17显性T细胞浸润。irAEs样本中B细胞和CD103单阳性细胞的百分比高于健康对照组。此外，结果还表明在22例irAE患者和银屑病患者中，CD8+和CD4+TRM细胞显著扩增。在cirAEs患者中，70%-90%的CD4+和CD8+T细胞表现出至少一种组织驻留特征（CD69或CD103单独表达或两者同时表达）（图1C和D）。相比之下，在健康对照组中，只有40%至65%的CD4+和CD8+ T细胞染色为TRM细胞标记阳性。
图1：与健康对照组相比，irAE皮炎显示TRM细胞扩张
为了确定irAE皮炎中含有TRM细胞的区域（spots）的转录谱，作者对两个cirAE和两个银屑病样本进行了空间转录组测序。利用h&e染色的组织来提供有关组织结构的信息。切片在视觉上分为表皮、表皮下淋巴细胞簇和真皮层（图2A）。进一步，作者从二维维度上可视化来自irAEs和银屑病样本的细胞簇。结果表明，irAE和银屑病的样本与五种主要的细胞簇有共同的空间和细胞组成。Cluster 0、Cluster1和Cluster5代表免疫细胞，主要由表皮下的淋巴细胞组成。Cluster 3和Cluster 4以成纤维细胞和死亡的角质形成细胞（角质层）为代表。在irAEs和银屑病样本中也有类似的细胞群分布。然而，在检测CD4/CD8和CD69共表达区域对应的转录谱时，发现了明显的差异。细胞因子基因TNFA、IFNG和IL15在irAEs中表达更多，而IL17A、IL17F、IL23A、IL23R和IL36A主要在银屑病中表达（图2B）。此外，从实验结果中，没有看到明显的Th2细胞因子的表达。IFNγ-诱导的基因如HLA-DRA、CD74和GBP5以及趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11在irAEs样本中的表达水平显著高于银屑病（图2C和D）。CXCL9/10/11可以通过参与CXCR3受体来招募效应T细胞。编码抑制性T细胞检查点分子PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM3和TIGIT的基因在cirAEs中高表达，而在银屑病中很少见（图2E）。
因此，作者设计了一个由IFNG、TBX21和STAT4组成的Th1评分，结果显示irAE样本中表达这些特征基因的CD3+CD69+ spots明显多于银屑病（图2F），表明Th1/Tc1细胞是irAE的显性细胞表型。相反，Th17相关基因RORC、IL17A、IL17F、IL36A、IL23A和IL23R的Th17评分显著高于银屑病（图2F）。编码调节性T细胞FoxP 3转录因子的基因在cirAEs和银屑病的CD3+CD69+区表达相似（图2F）。总之，这些数据表明irAEs皮炎以Th1/Tc1为中心的免疫反应。
图2：irAE皮炎的特征是Th1/Tc1 TRM细胞的抑制性检查点分子上调
进一步的，作者利用空间转录组学分析了7例irAEs结肠炎病例的独立队列。在图3A中，结果显示了h&e染色的irAEs结肠炎和TRM细胞的空间分布（CD4/CD8+CD69+ spots）的代表性图谱。这些病例的结果还显示了与Th1/Tc1反应相关的细胞因子和趋化因子的上调，包括IFNG、TNFA、CXCL9、CXCL10和CXCL11（图3B和C）。同样，从结果中还观察到IFN诱导的基因和检查点分子的上调（图3D和E）。在irAEs病例中，可见IL15的表达，而TRM细胞需要IL15才能分化和存活（图3B和2B）。最后通过将该结果与8个健康结肠样本进行了比较，发现Th1/Tc1细胞因子、CXCL9-11、ifn诱导的基因和检查点分子在irAE结肠炎中的表达比在健康结肠样本中更明显（图3B-E）。在irAEs皮炎和irAEs结肠炎中上调最多的是ITGA4，在银屑病中几乎不表达，在健康结肠中较少见。
图3：irAE结肠炎的特征是Th1/Tc1 TRM细胞和抑制性检查点分子的上调
作者还观察到含有STAT4、IFNG和CD4表达的spots共定位（图4A和B）， CD3E或CD69的表达与IFNG之间有很强的相关性。该分析证实了IFNG和CXCL10的强表达（图4C-G），这是在CD45+细胞中大量发现的（图4H-J）。然而，其他用DAPI而不是CD45染色的细胞核也显示了CXCL10的表达（图4H和J），这表明成纤维细胞和/或角质形成细胞可能在响应局部分泌的IFNγ时额外产生这种趋化因子。同样，CXCL9主要存在于CD45+细胞中，但在CD45-细胞中也较少。此外，作者还对主要定位于CD45+细胞内的TNFA转录本进行了染色。这种模式也反映在CD45+细胞内TNFA和CXCL9 mRNA更强的荧光强度上。同样的现象在8例irAEs结肠炎病例中也被发现了。TNFA和CXCL9的表达主要在CD45+细胞中。然而，上皮细胞也产生CXCL9。这与空间转录组分析的空间信息相对一致。
图4：irAE皮炎表现为Th1导向转录本
为了明确TRM细胞是否产生了关键的细胞因子，作者在对另外两个IF-RISH panel分析时，发现CD69+CD3+细胞在irAEs皮炎中产生了大部分的IFNG。通过联合IF-RISH探讨了大疱状irAE中Th2细胞因子产生的可能性。作者在CD69+CD3+细胞中发现了一些IL5的表达，这表明在大疱状irAEs中存在Th1/Th2混合反应。然而，IFNG的表达似乎占主导地位（图4H）。总之，这些结果证实了irAEs样本中Th1/Tc1显性免疫反应。
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